一．服務(wù)內(nèi)容

我公司提供的單細(xì)胞建庫(kù)測(cè)序技術(shù)服務(wù)是針對(duì)大規(guī)模細(xì)胞群體進(jìn)行表達(dá)譜分析，具體服務(wù)內(nèi)容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術(shù)對(duì)細(xì)胞懸液樣本中的500~10,000個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行捕獲標(biāo)記，同時(shí)對(duì)每個(gè)標(biāo)記了的細(xì)胞中的RNA分子進(jìn)行獨(dú)立標(biāo)記，建成用于illumina測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)。建成的文庫(kù)將在illumina NGS測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對(duì)測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行解碼，并針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜差異對(duì)樣本細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞亞群分析。

二．實(shí)驗(yàn)操作步驟概述

1. 對(duì)單細(xì)胞懸浮液樣本進(jìn)行10x Genomics上機(jī)，制備油包水微滴乳濁液（GEMS）。

2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。

3. 破乳后進(jìn)行cDNA的回收、純化和擴(kuò)增等操作。

4. 進(jìn)行片段化，末端修復(fù)，加A、加接頭，Sample Index PCR等后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建操作。

三．實(shí)驗(yàn)結(jié)果

我公司完成10x Genomics建庫(kù)技術(shù)服務(wù)的過(guò)程中提供2個(gè)結(jié)果，分別是文庫(kù)質(zhì)檢結(jié)果報(bào)告和測(cè)序結(jié)果分析報(bào)告。

四．樣品要求及注意事項(xiàng)

1. 接收的樣品為單細(xì)胞懸液，如需組織解離，細(xì)胞分選等樣品制備需由客戶自行完成。

2. 單細(xì)胞懸液中，細(xì)胞間無(wú)粘連，無(wú)大于40uM的細(xì)胞碎片或其他顆粒物），單細(xì)胞懸液上樣前需過(guò)40uM細(xì)胞濾網(wǎng)（如Falcon cell strainer, REF 352340），確保不會(huì)堵塞微流控通道。

3. 細(xì)胞懸液中單細(xì)胞個(gè)數(shù)應(yīng)大于預(yù)期實(shí)測(cè)細(xì)胞個(gè)數(shù)的2倍，如預(yù)期測(cè)到500個(gè)單細(xì)胞的數(shù)據(jù)，應(yīng)提供至少1000個(gè)單細(xì)胞。

4. 細(xì)胞成活率應(yīng)大于85%（用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)）。

5. 上機(jī)單細(xì)胞懸液體積應(yīng)小于30ul，建議細(xì)胞懸液濃度大約為1000個(gè)細(xì)胞/ul。

6. 如一次性上機(jī)多個(gè)樣品，第一個(gè)樣品制備完成到最后一個(gè)樣品制備完成時(shí)間相差不超過(guò)1個(gè)小時(shí)。

五．服務(wù)驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

在細(xì)胞樣品達(dá)到上述要求的前提下，結(jié)果達(dá)到如下標(biāo)準(zhǔn)：

1.測(cè)序文庫(kù)合格：文庫(kù)檢測(cè)為單峰，且濃度高于3nM，體積大于25ul。

2.細(xì)胞捕獲效率達(dá)到50%：最終測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果中的細(xì)胞數(shù)達(dá)到50%的起始細(xì)胞數(shù)。

六．服務(wù)承諾

1. 對(duì)于達(dá)到樣本要求的實(shí)驗(yàn)，由于細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差等實(shí)驗(yàn)中存在的不確定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在上述標(biāo)準(zhǔn)的±20%以內(nèi)都為可以接受的范圍。如果結(jié)果在驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)20%以下的（即捕獲效率低于40%）可判定實(shí)驗(yàn)失敗，公司將承擔(dān)該樣本的試劑耗材及服務(wù)費(fèi)等全部費(fèi)用。

2. 如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中確認(rèn)試劑耗材質(zhì)量的問(wèn)題，我公司負(fù)責(zé)向10x Genomics廠家申請(qǐng)賠付。（通過(guò)其它渠道采購(gòu)的試劑耗材，我們也將協(xié)助客戶完成索賠）

3. 如果細(xì)胞樣品未達(dá)到要求，客戶可以選擇重新送樣或風(fēng)險(xiǎn)上機(jī)，風(fēng)險(xiǎn)上機(jī)將不能按照上述標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)收。

七．常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標(biāo)準(zhǔn)是65%，為什么貴公司承諾只有50%？

答：廠家測(cè)試捕獲效率用的是細(xì)胞系，細(xì)胞系樣品很容易制備成單細(xì)胞懸液，且能保證較高的細(xì)胞活性和完整性，而服務(wù)項(xiàng)目客戶很少用細(xì)胞系，大部分是用組織解離制備的細(xì)胞懸液，其細(xì)胞成活率相對(duì)較低，而且細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法也會(huì)給結(jié)果造成一定偏差，因此我們把標(biāo)準(zhǔn)定在50%。

2. 建好的文庫(kù)送給測(cè)序公司上機(jī)前，文庫(kù)質(zhì)檢達(dá)不到測(cè)序公司的合格標(biāo)準(zhǔn)怎么辦？

答：測(cè)序公司出于免責(zé)的考慮，對(duì)客戶自建的文庫(kù)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)會(huì)比較嚴(yán)格，因此有可能我們庫(kù)檢沒(méi)問(wèn)題的樣品測(cè)序公司會(huì)判定為不合格。請(qǐng)把測(cè)序公司的文庫(kù)質(zhì)檢結(jié)果發(fā)送劉元和牛松，我們根據(jù)質(zhì)檢結(jié)果判定是否應(yīng)承擔(dān)測(cè)序上機(jī)風(fēng)險(xiǎn)。

3. 如果實(shí)驗(yàn)失敗了，貴公司如何賠償？

答：兩種情況，一是如果因10x芯片或試劑導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，我們負(fù)責(zé)聯(lián)系廠家索賠，服務(wù)項(xiàng)目就更換試劑耗材重新做實(shí)驗(yàn)。二是客戶細(xì)胞樣品合格、非風(fēng)險(xiǎn)上機(jī)情況下建庫(kù)失敗，就不收取費(fèi)用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的問(wèn)題，我們和客戶應(yīng)本著互信原則協(xié)商解決，實(shí)驗(yàn)失敗我們不對(duì)客戶細(xì)胞樣品進(jìn)行賠償。

4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)分析外，貴公司還能提供哪些分析？

答： 基本分析 

 ⑴ 提取測(cè)序序列 將bcl文件轉(zhuǎn)化為fastq，生成后期的樣本index序列文件，UMI序列及MRNA序列。

 ⑵ 序列比對(duì)注釋 將序列比對(duì)到相應(yīng)的參考基因組的基因區(qū)域。

 ⑶ 按照細(xì)胞和基因組信息統(tǒng)計(jì)UMI，barcode信息，計(jì)算細(xì)胞和基因表達(dá)矩陣。

   其他高級(jí)分析

 ⑴ t-SNE降維分析及聚類：利用T分布隨機(jī)相鄰嵌入法(t-SNE)對(duì)數(shù)據(jù)降維處理，基于2維數(shù)據(jù)展示。利用聚類算法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，聚類后的細(xì)胞群體之間進(jìn)行差異表達(dá)分析。

 ⑵ 基因的富集分析：差異基因進(jìn)行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。